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PCR實驗室為什么要隔離三區?
- 2022-05-06-

PCR實驗室為什么要隔離三區?

我們以前遇到過一些客戶,他們說PCR實驗總是假陽性的。顯然,他們沒有添加模板,但擴展了產品。如果這種現象經常發生,我們應該注意操作環境。如果你去百度搜索如果PCR假陽性怎么辦,以下建議將有防止交叉污染的建議。有人說模板DNA是一種溶解在去離子水中的大分子。它怎么能無緣無故地來污染環境?小編會一一解釋。

這里有一個氣溶膠的概念。氣溶膠是一種由固體或液體小質點分散并懸浮在氣體介質中形成的膠體分散系統,可在空氣中停留至少幾個小時。在PCR反應過程中,液體蒸發冷凝。PCR管中的空氣部分形成了氣溶膠,攜帶了大量的DNA擴展產品(請注意,1ng擴展產品中可作為模板的DNA片段數量超過1ng啟動模板中可擴展DNA片段數量的數百萬倍甚至更高。例如,人類基因組DNA有30億個BP,需要擴展的單個復制基因片段為300個BP。1ng啟動模板可作為模板DNA片段,僅占啟動模板DNA總量的千萬分之一)。如果在實驗室打開含有PCR擴展產品的管蓋,大量攜帶DNA擴展產品的氣溶膠將涌出并擴散到空氣中,從而污染環境。雖然DNA在整個空間環境中的含量很低,但理論上,只要有一個DNA片段可以作為模板,PCR擴展就可以成功,這就是為什么污染環境中的陰性對比也可以擴展帶。

因此,專業PCR實驗室如臨床PCR實驗室)通常需要四區隔離(或至少三區隔離)。

常見的三區是指:

1.試劑配制區:PCR反應系統配制區。

2.標本處理區:包括擴增模板的制備,即我們經常提取DNA的地方;

3.PCR擴增及產品分析區:PCR擴增區,也是凝膠電泳分析擴增產品的區域。

如果PCR擴增區域與產品分析區域再次分離,則為四區隔離。

四區隔離的主要目的是防止氣溶膠在每個PCR區域之間的流動——較好的方法是簡單地將每個區域與建筑隔開,這一定是較好的隔離措施,但操作當然是不現實的,因此有一種方法可以為不同區域設置正負壓:

試劑準備區(一區):在干凈的區域,保持微正壓,使外部空氣無法進入隔離污染源。此外,陰性模板應在該區域加入PCR管并蓋,嚴禁在該區域打開。存放帶DNA模板的離心管;

DNA模板添加區(二區):保持微負壓,確保內部空氣不泄漏,避免陽性模板的氣溶膠污染外部環境。

擴增及PCR產品分析區(三區):保持微負壓,防止內部空氣泄漏,避免擴增產品的氣溶膠污染外部環境。

操作時遵循一區→二區→三區的單一方向,不能逆向進行。

對于用于科研的PCR實驗室,如果不能滿足三區隔離的嚴格要求,至少應實現兩區隔離:即正壓區和負壓區。正壓區實施一區功能,負壓區實施二區功能。

忌諱、可怕的是在正壓區實施三區功能。我們有一個用戶,所有的實驗室都是正壓的——因為進入實驗室的空氣都被過濾掉了。他自信地認為他們的實驗室超級干凈,做PCR沒有問題,但他們的實驗室有嚴重的PCR產品污染問題——所有的陰性對比都是陽性的。因此,PCR實驗室的清潔度是次要的,不同區域之間的空氣是否相互循環是關鍵的。

如果有同學問,我們的實驗室沒有正負壓的區別,或者全負壓,全正壓呢?那么我們的建議是:不要怕麻煩,找一個遠離三區的實驗室(一般來說,就是打開PCR擴增產品的蓋子區,比如電泳區)作為PCRI區,可以省去后續更多的麻煩。

由于PCR三區隔離的目的是阻斷氣溶膠的交流,請注意以下細節,思考氣溶膠來自哪里:

1.每個區域應配備專用液體移除器,不得交叉混合。我們的一位用戶將電泳室的液體移除器添加到模板中,陰性對照擴大了明亮的條帶。

2.各區域應配備專用移液器吸頭,不得交叉混合。

3.如果條件允許,需要在PCRI區工作后更換實驗服.一次性鞋套.帽子.手套。

4.PCRI區配備帶濾芯吸頭。

許多做PCR的學生會對PCR進行吸頭滅菌,或者在超凈臺進行PCR操作。但在小編看來,這是完全沒有必要的,因為做好PCR重要的是防止擴增產品的污染,而不是無菌操作!想象一下,如果高壓滅菌,DNA不會降解太多。如果細菌DNA參與PCR擴展,DNA帶可以擴展到活菌或細菌尸體。

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